Quick-Zol (Trizol- reagente para isolamento de DNA, RNA e proteínas). Frasco com 100 ml.

QuickZol – Trizol Reagente

Condição de estoque: 4°C
Apresentação: frasco de 100 ml

Introdução
QuickZol Reagente é utilizado para o isolamento simultâneo de DNA, RNA e proteínas de amostras de tecidos ou células de animais, plantas, bactérias, vírus e leveduras. QuickZol é uma mistura de tiocianato de guanidina, tiocianato de amônia e fenol em uma solução monofásica que liza e/ou homogeneiza amostras de tecidos. Com a adição de clorofórmio, três fases distintas são geradas:

• Fase aquosa menos densa, contendo RNA;
• Fase intermediária, contendo DNA;
• Fase orgânica mais densa, contendo proteínas celulares.

Cada fase pode ser obtida utilizando protocolos específicos. 1 mL de QuickZol é suficiente para isolar RNA, DNA e proteínas de 100 mg de tecidos. O método para o isolamento de RNA total é bastante simples e pode ser realizado em menos de uma hora, resultando em RNA total intacto com baixa ou nenhuma contaminação de DNA e proteínas. O RNA isolado pode ser utilizado em ensaios de northern blots, isolamento de mRNA, tradução in-vitro, ensaios livres de RNase, clonagem e PCR. O DNA isolado pode ser utilizado em PCR, southern blotting e digestões com enzimas de restrição.

Componentes
Tiocianato de Guanidina, Tiocianato de Amônia, Fenol e Reagentes não tóxicos.

Protocolos

A. Tecidos
Adicionar 1 mL de QuickZol para cada 100 mg de tecido. Homogeneizar a amostra em um homogeneizador adequado.

B. Células de camada única
Lisar as células diretamente na placa de cultura, adicionando 1 mL de QuickZol para cada 3,5 cm de diâmetro (aproximadamente 10^6 células). Utilizar apenas placas de cultura de vidro, pois QuickZol não é compatível com placas de plástico. Homogeneizar a amostra ressuspendendo-a várias vezes com o auxílio de uma pipeta. Recomenda-se lavar as células de camada única com PBS ou meio sem soro antes de adicionar o QuickZol.

C. Células em Suspensão
Centrifugar as células (aproximadamente 5 x 10^6 células). Lisar as células adicionando diretamente 1 mL de QuickZol para células animais, vegetais ou bacterianas.

1. Para assegurar uma completa dissociação do complexo proteína-ácido nucléico, deixar a amostra por 5 minutos à temperatura ambiente.
2. Adicionar 200 μL de clorofórmio para cada 1 mL de QuickZol utilizado. Misturar vigorosamente em vortex por 15 segundos e deixar de 2 a 15 minutos em temperatura ambiente. Centrifugar a 12.000 x g por 15 minutos à 4°C.

Para isolar RNA

1. Transferir a fase aquosa para um tubo limpo e adicionar 500 μL de isopropanol (misturar por inversão).
2. Deixar a amostra por 10 minutos à temperatura ambiente e centrifugar a 12.000 x g por 10 minutos à 4°C.
3. Descartar o sobrenadante e lavar o RNA sedimentado com 1 mL de etanol 75% (misturar por inversão).
4. Centrifugar a 7.500 x g por 5 minutos à 4°C.
5. Descartar o sobrenadante, deixar secar o pellet e ressuspender o RNA em 25 μL de água/DEPC, livre de RNase.
6. Quantificar o RNA por espectrofotometria a 260 nm. Considerar 1 unidade de OD = 40 μg/mL. A amostra pode ser estocada à 4°C por no máximo 1 semana ou por 1 ano à -20°C.

Para isolar DNA

1. Descartar cuidadosamente a fase aquosa da amostra lisada e homogeneizada.
2. Adicionar à fase não aquosa (fenol-clorofórmio) 300 μL de etanol 100% para cada 1 mL de QuickZol utilizado na homogeneização inicial.
3. Misturar por inversão por 15 segundos e centrifugar a 2.000 x g por 5 minutos à 4°C.
4. Separar o sobrenadante (fase orgânica protéica impura) do precipitado (DNA sedimentado impuro). A fase orgânica pode ser armazenada em ultrafreezer por vários meses.
5. Lavar o DNA precipitado com 2 mL de etanol 75% para cada 1 mL de QuickZol utilizado anteriormente. Incubar por 30 minutos à temperatura ambiente, misturando por inversão a cada 10 minutos.
6. Centrifugar a 2.000 x g por 5 minutos à 4°C.
7. Descartar o sobrenadante e suspender o DNA sedimentado com etanol 100%.
8. Centrifugar a 2.000 x g por 5 minutos à 4°C.
9. Descartar o sobrenadante, secar o pellet e ressuspender o DNA precipitado com água ultrapura. Estocar o DNA à -20°C.

Purificação de Proteínas

1. Precipitar as proteínas da fase orgânica com 6 mL de isopropanol para cada 2 mL de QuickZol utilizado na preparação da amostra. Deixar a amostra em repouso por 5 minutos à temperatura ambiente.
2. Centrifugar a amostra a 10.000 x g por 10 minutos à 4°C.
3. Descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado com 3 mL de etanol. Deixar a amostra em repouso por 5 minutos à temperatura ambiente. Centrifugar a 10.000 x g por 10 minutos à 4°C.
4. Repetir o procedimento 3 por mais 2 vezes.
5. Descartar o sobrenadante e deixar a proteína sedimentada secar por 10 minutos à temperatura ambiente. Dissolver em água ultrapura. Utilizar a proteína imediatamente para Western blotting ou estocar à -20°C.