2x Hot Start PCR Master Mix

O PCR Master Mix Hot Start 2x permanence estável quando armazenado por 2 meses a 4ºC. Portanto, mantenha uma alíquota de uso frequente a 4ºC.

O PCR Master Mix Hot Start 2X é uma solução pronta para uso que contém Taq DNA Polimerase, anticorpo anti-Taq DNA polimerase, tampão de PCR, MgCl₂, dNTPs e estabilizadores. É idealizado para aplicações da rotina de PCR, utilizando amostras de DNA, colônias de bactérias e cDNA. Este mix é capaz de amplificar fragmentos de até 5kb.

O anticorpo anti-DNA Taq polymerase inibe a atividade da enzima promovendo um “início automático” após a denaturação inicial. Esta inibição protege a degradação da enzima neste passo, maximizando a sua ação nos ciclos de amplificação, além de proteger a enzima em temperatura ambiente. Devido a sua ligação específica ao anticorpo, o PCR Master Mix Hot Start 2X é normalmente inativo, sendo reativado depois do passo de desnaturação a 95°C.

Este protocolo está otimizado para reações de volume final 50 μL. O volume final pode ser modificado.
Ao realizar várias reações ao mesmo tempo, sugerimos preparar um mix com os componentes comuns a todas as reações a serem preparadas a fim de reduzir erros de pipetagem.

1. Descongele o Master Mix PCR a temperature ambiente. Homogenize a solução descongelada e centrifugue rapidamente para que todo o conteúdo do tubo fique no fundo.

Use amostras de boa qualidade, purificadas, para aumentar o sucesso da amplificação. Recomendamos reações com quantidade final de 50 μl:
DNA Genômico                                          1 ng–1 μg
DNA Plasmidial ou Viral                            1 pg–1 ng

Primers são sequências de 20–40 nucleotídeos de comprimento e idealmente tem quantidade de ligações GC de 40 a 60%. Programas de computador como Primer3 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) pode ser utilizado para desenhar ou avaliar um primer. A concentração final ideal de cada primer numa reação deve ser 0.05–1 μM, tipicamente 0.1–0.5 μM.
Mg⁺⁺ e aditivos:

A concentração de Mg⁺⁺ de 1.5–2.0 mM é ótima para a maioria das amplificações feitas com Taq DNA Polymerase.

A concentração final de Mg⁺⁺ no mix PCR Master Mix Hot Start 2X é 1.5 mM. Esta quantidade é satisfatória para a maioria dos amplicons. Entretanto a quantidade de Mg⁺⁺ pode ser otimizada através de incremento de 0.5 ou 1.0 mM de MgCl₂.

Em caso de amplificação de alvos mais difíceis, como sequências ricas em G-C, podem ser utilizados outros aditivos, como DMSO, betaina ou formamida. Veja informações adicionais sobre isso no link:
http://www.staff.uni-mainz.de/lieb/additiva.html

Desnaturação:
Um passo de desnaturação inicial de 30 segundos a 95°C é suficiente para fragmentos de DNA ficarem no estado ideal para iniciar a amplificação. Em casos de amostras mais difíceis (maior quantidade de G-C), é necessário avaliar um ciclo mais demorado de desnaturação (2–5 minutos a 95°C) antes de iniciar a ciclagem da reação. Em casos de templates de provenientes de colônias, desnaturação inicial de 5 minutos a 95°C é recomendada.
Um passo de desnaturação de 15 a 30 segundos a 95°C é recomendado nos ciclos de PCR.Anelamento:
O passo de anelamento dura tipicamente entre 15 e 60 segundos. A temperatura utilizada é baseada no T_m do par de primers e gira em torno de 45 a 68°C. A temperatura de anelamento pode ser otimizada através de uma reação de gradiente de PCR, iniciando 5°C abaixo da temperatura calculada de melting do par de primers.Extensão:
O passo de extensão é tipicamente feito na temperatura ótima de atividade da enzima Taq DNA polimerase: 72°C. Programe um minuto nesta temperatura para cada 1kb do tamanho do produto a ser amplificado nos ciclos de amplificação. Um passo final de extensão, depois de finalizados os ciclos de amplificação (geralmente 5 minutos a 72°C), é recomendado.Número de Ciclos:
Geralmente 25 a 35 ciclos rendem boa quantidade de produtos amplificados. Até 45 ciclos podem ser utilizados para detectar amostras com pouca quantidade inicial.

Produto de PCR:
Os produtos de PCR gerados utilizando Taq DNA polimerase contém cauda poli A na região 3´. Por isso estes produtos podem ser ligados a vetores que contenham sequência poli T/U.Ensaios de Controle de Qualidade

Ensaio Funcional:
Mix PCR Master Mix Hot Start 2X é testado para amplificar uma região de 2kb do gene da beta-globina numa amostra de 50ng de DNA genômico humano. O resultado desta reação é visualizado em gel de agarose corado com brometo de etídeo.Parâmetros de amplificação por PCR do gene da beta-globina:

Stage	Passo	Temp	Tempo
Hold	Desnaturação Inicial	95oC	2 min
30 ciclos	Desnaturação	95oC	30 seg
	Anelamento	55oC	15 seg
	Extensão	72oC	60 seg
Hold	Extensão Final	72oC	5 min

Primers utilizados para amplificar o gene da beta-globina humana:
2kb_Forward (5’ – TCT TGG CAG AGT GTA TGT GTC – 3’)
2kb_ Reverse (5’ – TAA CCG ATG AGA TCA ACT GGA A – 3’)
Teste de atividade nuclease:
Não foi detectada atividade endonuclease ou exonuclease.