HemaLise RBC-10X
Solução concentrada para Lise de glóbulos vermelhos, pH7.2
Código: 13-20151-01 – 100 mL
Armazenamento: 2-8°C
HemaLise RBC-10X. É uma formulação desenvolvida para a eficiente lise de glóbulos vermelhos em células individuais em suspensões de tecidos hematopoiéticos, como baço e hemácias do sangue periférico.
HemaLise-RBC 10X contém reagentes de alta qualidade usados para lisar células vermelhas apenas para um mínimo ou nenhum efeito prejudicial sobre os linfócitos.
Protocolos sugeridos:
Método I:
Lise de glóbulos vermelhos do baço de animais de experimentação.
1. Recolha e isole fragmentos do baço do animal de experimentação (rato, camundongo, coelho, etc.) para preparar uma suspensão de células. Utilizando os protocolos de fragmentação e separação de tecidos, previamente estabelecidos em laboratório.
2. Preparar um “pellet” com as células assim obtidas, centrifugando (350 x g) à temperatura ambiente durante 5 minutos e, com o auxílio de cuidadosa pipetagem remover o sobrenadante. Deixar só o “pellet”.
3. Paralelamente, diluir 1 parte da solução concentrada HemaLise-RBC 10X com 9 partes de água deionizada de excelente qualidade (Cód.: 13-12102-05).
Portanto, obtenha uma solução 1X (pronta para uso).
4. Ressuspender o sedimento (pellet) em 3-5 mL de 1X HemaLise.
5. Incubar no gelo (ou na geladeira entre 4- 8°C) por 4-5 minutos com agitação periódica.
5. Interromper a reação adicionando 10 a 20 mL de 1X PBS (Cód.: 13-30259-05).
6. Centrifugar as células (350 x g), eliminar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em um tampão apropriado de acordo com a técnica a ser usada. Pode ser 1X PBS, pH 7,2, ou DPBS 1X, pH: 7,2.
7. Realizar a contagem de células, ajustar a densidade e prosseguir com os protocolos de teste.
Método II:
Lise do Sangue Periférico hemácias humanas:
1. Diluir o tampão HemaLise-RBC 10X para a oncentração de trabalho (1 parte HemaLise
RBC 10X + 9 partes de água). Usar para este propósito; água deionizada de excelente qualidade (Labtrade, Cód.: 13-12102-05). Manter a solução pronta para uso em temperatura ambiente antes de usar.
2. Adicionar 2,0 mL de 1X HemaLise (pronto para uso) em cada tubo contendo até 100 L de sangue.
3. Misturar os tubo em vôrtex imediatamente após a adição da solução de lise. Incubar à temperatura ambiente, protegido da luz, por 10-15 minutos.
4. Centrifugar a 350 x g por 5 minutos. Remover o sobrenadante sem perturbar o “pellet” e ressuspender em buffer apropriado.
Referências:
1. Muirhead K., et al. 1986. Ann. NY Acad. Sci. 468: 113.
2. Mishell, B., et al. 1980. Preparação de suspensões de células do rato. Em: Selected Methods em Imunologia Celular. W.H. Freeman & Company, San Francisco, p. 23.
3. Boldin, M.P., et al. 2011. J Exp Med.
4. Adams RA, et al. 2007. J. Exp. Med. 204:571.
5. Feild-Corbett C, et al. 2009. Stem Cells
