One-Step RT-PCR

Protocolo para reações de RT-PCR

1. Programar o equipamento de PCR para a realização das reações de transcrição reversa (RT) e reação de polimerização em cadeia (PCR) em um único tubo com os seguintes parâmetros de temperatura e tempo de reação:

Opcionalmente, incluir uma etapa final de extensão constituída por um ciclo na temperatura de 68^oC por 5 minutos.
A temperatura ótima da reação de transcrição reversa pode variar entre 45^oC a 60^oC dependendo da sequência alvo e condições da reação. Da mesma forma, a temperatura ótima da etapa de pareamento dos primers (“annealing”) da reação de PCR pode variar entre 55^oC a 65^oC.

2. Preparar a mistura de amplificação da Reação de RT-PCR.

Adicionar os seguintes reagentes para uma reação de volume final 50μL:

Para múltiplas reações, preparar uma mistura principal contendo 2X Tampão de Reação RT-PCR, Primer Direto, Primer Reverso, Enzimas One-Step RT-PCR e Água para Biologia Molecular, adicionar o volume correspondente nos microtubos ou poços da microplaca de amplificação e a seguir, adicionar o RNA alvo purificado por um kit ou reagente de biologia molecular.

4. Colocar os microtubos ou microplaca no termociclador e iniciar a reação de RT-PCR.

Notas sobre a otimização da Reação de RT-PCR:
– Concentração de MgSO₄    
A solução 2X Tampão de Reação RT-PCR contém sulfato de magnésio para concentração final de 1,6mM. Esta concentração geralmente é suficiente para a maioria dos alvos de RNA. Caso o usuário tenha o interesse de otimizar a reação de RT-PCR, adicionar a solução de 5mM MgSO₄ conforme os volumes apresentados abaixo:

Reações de RT-PCR com volume final de 50μL:

• Disponibilidade: produto feito sob encomenda
• Pagamento no momento do pedido: 100% de sinal